Techniques utilisées au CORD

Université de Liège - Centre de l'Oxygène, Recherche et Développement (C.O.R.D.)

Les techniques, méthodes et modèles

Les techniques

La mesure de la contraction d'un organe isolé (utilisée durant la période antérieure à la création du CORD)
Cette technique a été mise au point pour étudier la synthèse du thromboxane (contraction) ou de la prostacycline (relaxation) par un organe isolé sous l'effet de l'ajout d'acide arachidonique. Elle a été publiée en 1971. La contraction d'un morceau d'organe, plongé dans un bain thermostaté, est mesurée par la variation de la lumière transmise au travers de deux verres polarisés dont l'un est fixe et l'autre mobile, relié à l'organe par l'intermédiaire d'une poulie.
     Deby C, Espreux G, Topa C. Appareil d'enregistrement électrique des contractions musculaires de faible amplitude. Experientia 1971; 28: 114-5.

Les techniques de chromatographie
Le CORD utilise la chromatographie en couche mince (CCM ou Thin Layer Chromatography), la chromatographie en phase gazeuse (GLC, colonnes capillaires et colonnes remplies, détection FID), la chromatographie en phase liquide type HPLC (détection: spectre UV/visible, "evaporative light scattering detector") et la chromatographie de purification des protéines (filtration sur gel, échange ionique et affinité).

Les techniques de cultures cellulaires
Elles sont utilisées pour les lignées continues humaines THP-1, HL-60 et A549 et la lignée de synoviocytes de lapin HIG-82, et ont été mises au point pour plusieurs lignées primaires: monocytes, cellules endothéliales et kératinocytes humains, cellules endothéliales, kératinocytes, entérocytes et cellules musculaires squelettiques équines. Les cultures de cellules musculaires équines sont initiées à partir d'explants obtenus par microbiopsie in vivo (technique originale). Les cultures primaires sont toujours caractérisées par technique immunohistochimique utilisant des anticorps dirigés contre une(des) protéine(s) spécifique(s) de la cellule mise en culture (observation en microscopie de fluorescence et analyse d'image).

Les techniques immunologiques
• Des techniques immunologiques de mesure "radio-immunoassay" (RIA) ont été développées pour les prostanoïdes (6-keto PGF_1α, TXB₂, PGE₂) dans les années 1980, dans les années 1990 pour la myéloperoxydase humaine et la myéloperoxydase équine et au début des années 2000 pour la trypsine équine.
Serteyn D, Deby-Dupont G, Pincemail J, Mottart E, Philippart C, Lamy M. Equine postanaesthetic myositis: thromboxane, prostacyclin and prostaglandin E2 production. Vet Res Commun. 1988; 12(2-3): 219-26.
Deby-Dupont G, Pincemail J, Thirion A, Deby C, Lamy M, Franchimont P. Self-labeling of human polymorphonuclear leucocytes myeloperoxidase with ¹²⁵I. Experientia 1991; 47: 952-7.
Pincemail J, Deby-Dupont G, Deby C, Thirion A, Torpier G, Faymonville ME, Damas P, Tomassini M, Lamy M, Franchimont P. Fast double antibody radioimmunoassay of human granulocytes myeloperoxidase and its application to plasma. J Immunol Methods 1991; 137: 181-91.
Mathy-Hartert M, Bourgeois E, Grulke S, Deby-Dupont G, Caudron I, Deby C, Lamy M, Serteyn D. Purification of myeloperoxidase from equine polymorphonuclear leucocytes. Can J Vet Res. 1998; 62: 127-32.
Deby-Dupont G, Grulke S, Caudron I, Mathy-Hartert M, Benbarek H, Deby C, Lamy M, Serteyn D. Equine myeloperoxidase in plasma: design of a radio-immunoassay and first results in septic pathologies. Vet Immunol Immunopathol. 1998; 66(3-4): 257-71.
Grulke S, Deby-Dupont G, Gangl M, Franck T, Deby C, Serteyn D. Equine trypsin: purification and development of a radio-immunoassay. Vet Res. 2003; 34(3): 317-30.

Des techniques ELISA ont ensuite été développées pour la myéloperoxydase équine et l'élastase granulocytaire équine. Le développement de ces techniques fut lié à la purification des ces deux enzymes et à l'obtention d'anticorps dirigés contre chacune d'entre elles. Des trousses de dosage ELISA de ces deux enzymes et les composants de la trousse (enzyme et anticorps) sont disponibles via la spin-off BiopTis.
Franck T, Grulke S, Deby-Dupont G, Deby C, Duvivier H, Peters F, Serteyn D. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for specific equine neutrophil myeloperoxidase measurement in plasma. J Vet Diagn Invest. 2005; 17: 412-9.
de la Rebière de Pouyade G, Serteyn D, Deby-Dupont G, Franck T. Method for co-purification of equine neutrophil elastase and myeloperoxidase from a limited blood volume. Res Vet Sci. 2009 Apr 29. [Epub ahead of print].
de la Rebière de Pouyade G, Franck T, Deby-Dupont G, Salciccia A, Grulke S, Serteyn D. Development of an enzyme-linked immunosorbent assay for specific equine neutrophil elastase measurement in blood. Vet Immunol Immunopathol. soumis.

• Le CORD a conçu une technique originale de mesure de l'activité d'une enzyme en milieu biologique complexe (plasma, liquide pleural, liquide d'ascite, lavage alvéolaire, liquide synovial, liquide séminal...) sans interférence des composants du milieu sur la mesure de l'activité de l'enzyme. Cette méthode a été dénommée SIEFED pour « Specific ImmunoExtraction Followed by Enzymatic Detection ». Elle consiste à extraire l’enzyme du milieu par fixation sur des anticorps immobilisés, spécifiques pour l’enzyme, puis à révéler l’activité de l’enzyme isolée, fixée sur les anticorps. Cette méthode, qui a été développée pour la myéloperoxydase des neutrophiles équins, est en cours de validation pour la myéloperoxydase des neutrophiles humains et en développement pour la NADPH-oxydase des neutrophiles humains.
Franck T, Kohnen S, Deby-Dupont G, Grulke S, Deby C, Serteyn D. A specific method for measurement of equine active myeloperoxidase in biological samples and in in vitro tests. J Vet Diagn Invest. 2006; 18: 326-34.

La technique SIEFED est aussi un instrument de recherche pharmacologique innovant pour mesurer, sur l'activité de la myéloperoxydase, l’activité modulatrice anticatalytique (c'est à dire agissant sur le site actif de l'enzyme) d’une molécule (ou d'un mélange de molécules) naturelle ou de synthèse (antioxydant), sans interférence possible de cette molécule avec les espèces oxydantes produites par l’enzyme (voir Initiation au métabolisme de l'oxygène, chapitre XV). Il devient ainsi possible de rechercher des inhibiteurs anticatalytiques de l'enzyme, infiniment plus efficaces (à faibles doses) et plus spécifiques que les inhibiteurs stœchiométriques (pour une distinction entre inhibiteur catalytique et stœchiométrique, voir Initiation au métabolisme de l'oxygène, chapitre XV). Le SIEFED de la myéloperoxydase a été appliqué avec succès à la recherche de propriétés antioxydantes anticatalytiques de molécules simples (resvératrol, curcumine, flavonoïdes ...) et de mélanges complexes (vins rouges).
Kohnen S, Franck T, Van Antwerpen P, Zouaoui Boudjeltia K, Mouithys-Mickalad A, Deby C, Moguilevsky N, Deby-Dupont G, Lamy M, Serteyn D. Resveratrol inhibits the activity of equine neutrophil myeloperoxidase by a direct interaction with the enzyme. J Agric Food Chem. 2007; 55 : 8080-7.
Franck T, Kohnen S, Grulke S, Neven P, Goutman Y, Peters F, Deby-Dupont G, Serteyn D. Inhibitory effect of curcumin and tetradydrocurcumin on equine activated neutrophils and myeloperoxidase activity. Physiol Res. 2008 ; 57(4): 577-87.
Mouithys-Mickalad A, Kohnen S, Franck T, Niesten A, Deby-Dupont G, de la Rebière G, Neven P, Serteyn D. New in vitro screening tools to study the antioxidant activities of natural substances on stimulated neutrophils: application to red wines. 3th International Symposium, Nutrition, Oxygen Biology and Medicine, Paris, France, April 8-10th, 2009.

Les techniques spectrophotométriques
Des techniques spectrophotométriques adaptées à la mesure des produits d'oxydation des lipides ont été développées:
   • pour l'analyse des peroxydes lipidiques in vitro (technique à la diméthyl paraphénylène diamine, adaptée d'une technique de chimie organique appliquée en couche mince)
     Deby C, Deby-Dupont G, Hans P, Pincemail J, Neuray J. Complementary procedures for pro- and anti-lipoperoxidant activities measurements. Experientia 1983; 39(10): 1113-5.
   • pour l'analyse des diènes conjugués formés par l'attaque oxydante sur les acides gras polyinsaturés. La qualité des nouveaux spectrophotomètres permet d'appliquer cette technique avec plus de facilité et lui donne un renouveau remarquable .

Le CORD maîtrise aussi d'autres techniques spectrophotométriques d'utilisation classique dans les recherches sur les espèces oxygénées activées (ROS), comme la décroissance d'un radical libre (DPPH ou autre) ou le dosage de la malonedialdéhyde (MDA ou TBARS), mais elles sont utilisées in vitro exclusivement. La mesure de la MDA dans les échantillons complexes comme le plasma ou les extraits cellulaires est exclue (non spécifique, influence du fer, impossibilité de formation à partir de l'acide linoléique, le plus abondant in vivo).

Les techniques de fluorescence
Les techniques de fluorescence classiques pour la détection des ROS utilisent la fluorescence de la dichlorofluorescéine ou celle de la rhodamine. La dichlorofluorescine-diacétate (DCFH-DA) est utilisée en présence d'une peroxydase (la horse radish peroxidase) pour mesurer la production du peroxyde d'hydrogène in vitro. La technique à la DCFH-DA peut être utilisée sur modèles cellulaires: à l'intérieur de la cellule, la molécule de DCFH-DA est désacétylée et son oxydation par la peroxydase en présence d'H₂O₂ (résultant de la formation d'anion superoxyde) la transforme en dichlorofluorescéine (DCF) fluorescente, mais cette technique ne peut pas être considérée comme spécifique du "stress oxydant". La DCF formée peut générer un radical phénoxyle qui va participer à la production de nouvelles espèces en amplifiant la fluorescence de manière variable selon la concentration intracellulaire en réducteurs: c'est le "redox cycling" décrit par Rota et al*. Il en va de même pour la dihydrorhodamine oxydée en rhodamine fluorescente de manière non spécifique par les ROS. Ces techniques, utiles in vitro, doivent être utilisées avec la plus grande prudence sur cellules vivantes pour l'étude d'une production de ROS.
* Rota C et al. JBC 1999; 274: 28161.

Les techniques de chemiluminescence
La chemiluminescence permet la détection globale des ROS, mais sans les identifier. Elle est utilisée sans amplificateur ("ultra-weak") pour l'étude de certaines réactions chimiques, notamment celles impliquant le peroxynitrite ou l'oxygène singulet, mais la faiblesse du signal nécessite un appareillage de très haute sensibilité.
La chemiluminescence assistée (en présence d'un amplificateur, la lucigénine) est utilisable pour l'étude de l'activation cellulaire, particulièrement les leucocytes polymorphonucléaires. Elle est présentée comme spécifique de la production d'anion superoxyde, mais elle est sensible au "redox cycling" (passage à l'état radicalaire et réaction avec l'oxygène moléculaire pour produire de l'anion superoxyde) lorsque la production d'anion superoxyde est faible. Elle doit être appliquée aux études sur cellules avec la plus grande prudence, en association avec d'autres procédés.

L'oxymétrie à haute sensibilité
Elle permet la mesure de la consommation d'oxygène sur mitochondries isolées, sur cellules en culture et sur tissus, même lorsqu'ils sont obtenus sous forme de microbiopsies. Cette technique de pointe est utilisée au CORD:
• pour l'étude des altérations de la chaîne respiratoire mitochondriale des cellules endothéliales et cellules musculaires équines en culture, en interaction avec les leucocytes polymorphonucléaires neutrophiles activés ou après anoxie suivie de réoxygénation;
• sur microbiopsies musculaires équines obtenues in vivo pour analyser les effets d'un effort intense sur les mitochondries (chevaux de compétition), du sepsis ou de l'anesthésie;
• pour suivre la consommation d'oxygène lors de l'activation des neutrophiles ("flambée respiratoire").

La résonance paramagnétique électronique (RPE)
Cette technique de détection des radicaux libres est utilisée soit directement soit en présence de piégeurs de spin avec un appareil Bruker ESP 300 informatisé, muni d'un régulateur de basse et de haute température. L'installation est située au Laboratoire de Spectroscopie Biomédicale (Pr M Hoebeke), membre du CORD.
La RPE est utilisée pour la détection et l'identification des radicaux libres produits lors de certaines réactions chimiques in vitro, par les cellules phagocytaires ex vivo et par les cellules en culture, sous l'effet d'une stimulation ou de l'anoxie-réoxygénation.

Les méthodes et modèles

Au fur et à mesure de l'évolution des recherches, l'Unité de Biochimie puis le CORD ont mis au point des méthodes et des modèles originaux.

- analyse des prostaglandines par chromatographie en phase gazeuse et détection de capture d'électron: cette méthode a été utilisée dans le début des années 1970, mais elle est longue et délicate et a été remplacée par les dosages immunologiques de type ELISA.
       Deby C, Magotteaux G. Dosage des prostaglandines par chromatographie en phase gazeuse et détection de capture d'électrons. Arch Int Physiol Biochim. 1971; 79(4): 824-5.

- analyse des acides gras libres à partir du plasma: extraction au mélange chloroforme:méthanol (2:1), gravimétrie des lipides récoltés, isolement des classes lipidiques par CCM, élution de la zone correspondant aux acides gras libres, méthylation au diazométhane et analyse des esters méthylés d'acides gras par GLC (détection FID), identification par comparaison avec un mélange étalon et quantification par étalon interne.
      Deby-Dupont G, Ducarne H, De Landsheere C, Ancion JC, Noël FX, Radoux L, Deby C. Intense rises of unesterified arachidonic plasma levels in stressed humans. Biomed Pharmacother. 1983; 37(8): 386-91.

- méthode originale de co-purification de l'élastase et de la myéloperoxydase équines: à partir des neutrophiles isolés d'un même échantillon de sang, trois étapes de chromatographie permettent d'isoler les deux enzymes en quantité suffisante pour une utilisation de longue durée dans des méthodes immunologiques de type ELISA ou SIEFED.
      de la Rebière de Pouyade G, Serteyn D, Deby-Dupont G, Franck T. Method for co-purification of equine neutrophil elastase and myeloperoxidase from a limited blood volume. Res Vet Sci. 2009 Apr 29. [Epub ahead of print]

- étude de la peroxydation lipidique par mesure du dégagement de pentane en chromatographie en phase gazeuse: l'attaque d'un acide gras à deux doubles liaisons ou plus (acide linoléique, linolénique etc.) par des espèces radicalaires (libérées in situ) conduit à une cassure de la molécule et à la libération d'un hydrocarbure saturé à courte chaîne, le pentane, qui s'accumule dans la phase gazeuse au-dessus du milieu réactionnel (réaction en fiole scellée) et qui est quantifié par GLC. Cette méthode permet d'étudier la capacité de composés (naturels ou de synthèse) à inhiber la lipoperoxydation.

- étude de l'activité oxydante des cellules en suspension par mesure du dégagement d'éthylène en chromatographie en phase gazeuse: des neutrophiles ou des monocytes (cellules THP-1) sont stimulés en présence d'un substrat oxydable, l'acide alpha-kéto-gamma-méthylbutyrique (KMB), en fiole scellée. L'oxydation du KBM par les ROS produites par les cellules activées dégage de l'éthylène qui s'accumule dans la phase gazeuse et est mesuré par GLC.

- adaptation de la mesure de l'éthylène aux cellules adhérentes cultivées en multipuits: pour éviter le détachement des cellules adhérentes (cellules endothéliales, cellules musculaires, kératinocytes), la réaction de stimulation en présence de KMB est faite dans les puits de culture; ceux-ci sont rendus étanches en plaçant la plaque de culture en multipuits dans le système de contention présenté sur la figure ci-dessous, tout en permettant la prise d'échantillon pour la GLC.
        Deby-Dupont G, Mouithys-Mickalad A, Serteyn D, Maurice Lamy, Deby C. Resveratrol and curcumin reduce the respiratory burst of Chlamydia-primed THP-1 cells. Biochem Biophys Res Commun. 2005; 333: 21–7.

- modèle d'étude en chemiluminescence "ultra-weak" couplée à la RPE: ce modèle a été utilisé pour suivre en cinétique au cours d'une réaction chimique, la production de chemiluminescence (témoin d'une production de ROS) et la formation d'espèces radicalaires observées et identifiées par RPE.
       Mouithys-Mickalad A, Kohnen S, Deby C, Noels AF, Lamy M, Deby-Dupont G. Peroxynitrite reacts with biological nitrogen-containing cyclic molecules by a radical pathway, as demonstrated by ultraweak luminescence coupled with ESR technique. Biochem Biophys Res Commun. 1999; 259(2): 460-4.

- modèle d'étude en oxymétrie couplée à la RPE: ce modèle a été conçu pour l'étude de l'anoxie-réoxygénation des cellules en culture. La consommation d'oxygène est enregistrée en continu jusqu'à l'arrivée des cellules en anoxie; l'anoxie est maintenue pour une période déterminée et, dès la réoxygénation, on poursuit la mesure de la consommation d'oxygène avec en parallèle, à différents moments, l'étude de la production d'espèces radicalaires par RPE. Il possible d'effectuer ainsi des cycles d'anoxie-réoxygénation. Ce modèle a été utilisé pour les cellules alvéolaires humaines, pour les chondrocytes et synoviocytes équins et est en cours d'application pour les cellules endothéliales et les cellules musculaires équines.
      Mouithys-Mickalad A, Mathy-Hartert M, Du G, Sluse F, Deby C, Lamy M, Deby-Dupont G. Oxygen consumption and electron spin resonance studies of free radical production by alveolar cells exposed to anoxia: inhibiting effects of the antibiotic ceftazidime. Redox Report 2002; 7(2): 85-94.
      Schneider N, Mouithys-Mickalad A, Lejeune JP, Deby-Dupont G, Hoebeke M, Serteyn D. Synoviocytes, not chondrocytes, release free radicals after cycles of anoxia/re-oxygenation. Biochem Biophys Res Comm. 2005; 334: 669-73.

- modèle de co-culture des cellules primaires: il consiste à cultiver des cellules adhérentes en présence de cellules flottantes contenues dans un "insert" placé au-dessus de la couche de cellules adhérentes et permet l'étude des interactions cellulaires par la voie d'une production de médiateurs (co-culture de longue durée synoviocytes/chondrocytes équins, co-culture de courte durée cellules endothéliales/neutrophiles).

- modèle de formation des cellules spumeuses (foam cells): des monocytes humains (cellules THP-1), cellules flottantes, sont infectées par Chlamydia pneumonia, ce qui induit leur transformation en macrophages adhérents (partie gauche de la figure ci-dessous). L'addition de lipoprotéines humaines de faible densité (LDL) non oxydées ni acétylées amène ensuite la transformation des macrophages en cellules spumeuses, bourrées de vésicules lipidiques (partie droite de la figure ci-dessous), colorables à l'Oil Red O. Ce modèle doit servir à l'étude des mécanismes de développement de l'athérosclérose liés à l'activité oxydante cellulaire. Ces recherches sont actuellement interrompues faute de crédit.

Cellule THP-1 infectée par Chlamydia pneumoniae et transformée en macrophage par ce microorganisme (coloration au Giemsa). Le macrophage obtenu par infection par Chlamydia se transforme en cellule spumeuse ou foam cell (remplie de vésicules lipidiques) par contact avec des LDL humaines (coloration au Giemsa).

- étude des effets antioxydants d'une substance par la méthode AMADEOX: la distinction entre antioxydant à action stœchiométrique (neutralisation d'une espèce activée de l'oxygène par une molécule antioxydante) et antioxydant à action anticatalytique (de une à quelques molécules d'antioxydant pour neutraliser l'activité d'une enzyme productrice de milliers d'oxydants) est essentielle (voir Initiation au métabolisme de l'oxygène, chapitre XV). La nécessité d'arriver à cette distinction a amené le CORD à mettre au point la méthode AMADEOX (Action Modulatrice de l'Activité Des Enzymes Oxydantes) regroupant 6 techniques. La figure ci-dessous résume l'essentiel d'AMADEOX.